原代細胞培養

（一）原理

從供體獲取組織細胞的首次培養叫原代細胞培養或初代細胞培養(primary culture)。原代細胞離體時間短，具有二倍體遺傳性，在一定程度上能反映體內生長特性，很適合作藥物測試、細胞分化和轉化等實驗研究。在臨床應用中，短期原代培養細胞的移植療效明顯高于未經培養的組織細胞。故體外培養的人體各部位細胞，尤其是上皮細胞對于研究各種疾病的發生、發展及防治都具有重要意義。根據不同的實驗目的，不同的實驗材料，解離或分離細胞的方法和條件各有不同。一般常用方法有二：一是組織塊培養法，二是單層細胞培養法。本實驗采用胰蛋白酶消化法，對初生乳鼠肺組織進行原代培養。

（二）實驗用品

1. 材料：新生乳鼠。

2. 器材：眼科剪、眼科鑷、泡器械（直徑 15cm ）培養皿、動物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培養瓶、離心管、廢液瓶、倒置顯微鏡、二氧化碳培養箱、電磁攪拌器。

3. 試劑：Hank’s液、RPMI-1640液、血清細胞培養液、安爾碘、酒精。

（三）無菌操作基本要領和要求

1.操作準備：把實驗用品放置于超凈臺內，打開紫外線殺菌燈和超靜臺風機，30分鐘后關閉紫外線燈。由于紫外線消毒時產生臭氧，對身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。實驗溶液恢復至室溫后使用，培養細胞和培養用液等避免紫外線照射。

2.洗手：雙手經洗手、泡手、酒精消毒，原則上和外科手術相同。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入超凈臺內，洗刷時一定要清洗到肘部。

3.火焰消毒：在無菌環境進行培養或做其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈。以后操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經過火焰燒灼后在火焰近處進行。金屬器械在火焰上燒得時間不能過長，以防退火。燒過的金屬都要冷卻后再使用，以免造成組織損傷。已吸取過營養液的吸管不能再用火焰燒灼，因吸管頭中殘留營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入培養液中。消毒火焰要求無色或微藍色，而紅黃色或發黑的火苗，表示燃燒不完全或含有雜質，有害物能混入培養液內。因此酒精燈需用96％的不含雜質的酒精，絕不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。

4.培養操作：進行培養操作時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，如不便消毒時，應取備品更換。為便于拿送用品，工作臺面上的用品要有合理的布局；原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央。培養液在用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口。培養用瓶開口以后，應保持45度斜位或平放，長時間開口向上直立可增加落菌機會。吸取營養液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或導致交叉污染。工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發生污染。

（四）操作步驟

1. 組織塊法（以乳鼠肺組織原代培養為例）

（1）取材將1-3天新生乳鼠，尾巴提起，整個身體浸入75%酒精的燒杯中3秒左右（默數5下），取置滅菌的培養皿中，移入工作臺內。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大頭針分別固定鼠頭、尾和四肢。安爾碘消毒胸廓部位皮膚。在胸廓正中線中位處，用兩把眼科彎鑷（第1套器械）夾起皮膚（多夾些），向左右兩側頭端撕拉，膈肌部位皮膚向尾端拉，膈肌部位皮膚向尾端拉，皮膚外翻固定，軀干部肌肉暴露（注意！不要使表皮面接觸到已暴露出來的胸腹?。?。酒精消毒胸廓后，沿著膈膜剪斷胸廓，并將胸骨兩側肋骨剪斷（第II套器械）。胸廓暴露后，可見跳動心臟和粉紅色肺。將眼科鑷彎頭端向上（第III套器械），從心臟右上方位插入心肺連接處，輕輕向上用力，將心肺一齊取出，用鑷子去除心臟，移入已加Hank's液的青霉素瓶內。

（2）漂洗

用Hank’s液漂洗肺臟表面血污，然后粗剪幾下，再用Hank's液漂洗多次后，吸去多余水分。

（3）剪切

組織小塊置青霉素瓶一角（上圖），眼科直剪用力反復剪切組織塊成 1mm3大小，剪切時為保持組織濕潤，可以向組織塊滴加1-2滴血清培養液。此過程約15-20分鐘。

（4）接種

剪切后加少量培養液至1mm3大小的組織小塊中。用吸管頭將組織小塊移入培養瓶中，小塊均勻擺置，塊間距0.3cm 左右，加蓋。輕輕翻轉培養瓶，瓶接種面向下， 37℃ 、5%CO2培養。1-4小時后，組織小塊貼附瓶壁，從瓶側面加入培養液，再輕輕翻轉培養瓶，使液體慢慢覆蓋組織小塊，靜止培養，逐漸從組織塊周邊生出新細胞。

2. 消化法（以0.25%胰蛋白酶為例，pH 7.4-8.0為例）

（1）（2）（3）步同組織塊法

（4）消化

用Hank's液將剪刀面組織小塊沖入青霉素瓶內，然后將瓶內小組織塊用Hank's液移入離心管中，低速離心（500-800轉），7分鐘。用吸管去除上清液，加入沉淀量的5-8倍0.25%胰蛋白酶液，混勻后加入磁棒并套好離心管塞。離心管放入電磁攪拌器上的 37℃ 水浴杯內。隨消化時間的增加，組織塊顏色逐漸變白，分離細胞逐漸增多，消化液混濁，消化合適時，常見消化液中有一團松散的白色絮狀物（這是因為剛分離單細胞的膜表面有粘性，磁力攪拌作用使它們相互松散結合在一起）或消化液呈白色均勻的渾濁物。此時要及時終止消化。取出離心管。

（5）制備消化細胞懸液

離心管外壁和管口處經酒精消毒后進入超凈臺內。管口火焰消毒，HanK's液加至10ml。吸管插入管底,吸管頭反復輕輕吹打松散組織，使其順利地通過吸管口，分散成單細胞和小細胞團狀態。離心管直立靜置片刻，未消化組織塊自然沉降（可加消化液再消化）。將細胞懸液移至另一離心管（管內先加1ml血清細胞培養基）中，補加Hank's液至10ml，細胞混勻后低速離心（速度、時間同前）。去上清液。

（6）接種加20%血清細胞培養液，細胞混勻計數，調整細胞濃度為5.0×105/ml的密度接種到培養瓶，移入 37℃ ，5%CO2溫箱中培養。

（四）結果

1.組織塊法培養的細胞觀察

在倒置顯微鏡下，經24小時培養的組織塊邊緣有少量梭形或長條形細胞游離出來，隨著培養時間延長，組織塊周圍的細胞數量越來越多，呈放射狀向外擴展，最邊緣的細胞能夠通過變形運動向外延伸，細胞密度較大時才連成片，反之，則連接成網狀。這些細胞的核明顯，呈橢圓形。胞質均勻，透明度大，靠近組織塊的細胞體積較小，離組織塊較遠的區域細胞體積較大。

2.胰蛋白酶消化法培養的細胞觀察

用倒置顯微鏡觀察發現，剛接種于培養瓶中時，細胞是圓形、懸浮的。24h后，多數細胞附著于培養瓶底部（貼壁），胞體伸展，常向外伸出2-3個長短不同的突起，由于突起數目不同，細胞形態有梭形、扇形或星形。細胞邊緣不整齊、胞漿透亮。細胞核呈橢圓形，核仁明顯。

（五）注意事項

1.吸液體前，瓶口和吸管火焰消毒。吸液體時，聽不到兩者的碰撞聲。

2.離心管入臺前，做好管口、管壁消毒。

3.實驗者離開超凈臺時，要隨即用肘部關閉工作窗。

4.器械用后用酒精棉球擦去血污，泡入另一個皿中，器械浸泡時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，皿加蓋繼續消毒。

5.器材使用時既要注意消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。

火焰消毒的吸管一定要經Hank's液冷卻和濕潤管內壁（這是因為剛分離的組織細胞易粘在管壁上）。

6.超凈臺內溫度、濕度較大，夏天工作臺內散熱慢，細胞懸液混勻、接種時，離火焰要稍遠些。

7.組織塊剪切時，用吸管頭將組織塊細胞推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向對側的多余水分。多余水分若不除去，則組織塊剪切不細，消化后細胞懸液清亮（細胞數少）并可見消化液中有線性絮狀物漂浮。

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