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NF-KB p65活性檢測實驗

簡介: NF-KB p65活性檢測實驗 提供商: 星森林(浙江)生物 服務名稱: NF-KB p65活性檢測實驗 地區: 全國 規格: 實驗服務 丙



【星森林生物】核轉錄因子NF-kappaB(NF-kB)是一種重要的轉錄因子,參與調控多種與炎癥、抗凋亡、 腫瘤形成和轉化有關的基因表達。 

NF-kappaB(NF-kB)最初被鑒定為在B細胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強子結合。但隨后在非B-細胞的細 胞質中被發現,形成NF-kB和IkB的復合物。最初在DNA結合蛋白復合物中分離的NF-kB是由p65(RelA)和 p50構成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49(也可稱為p52),p75(c-Rel),p68(RelB)。p65, p68,p75單體起反式激活作用。p50,p49(p52)單體具有DNA結合活力,但只具有微量的反式激活作 用。據報道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉錄活力的異源雙體,類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和 p50/ p65異源雙體在細胞質中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調節。

IkB和p65單體結合,阻制了細胞核中的定位和DNA的結合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體,能和 DNA微弱地結合。Poly(dI:dC)能抑制這一反應(14)。p49和p50也能形成同源雙聚體,但在細胞中的濃 度很低。通常,在作NF-kB的凝膠遷移實驗時,在20ul的反應體積中,有溶于10 mM HEPES的 0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP40。當用純化的蛋白時,250-300ng足以形成凝膠遷移復合物,而需用10ug的HeLa細胞核抽提物。凝膠 遷移復合物在室溫中保溫30分鐘,在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙.烯.酰胺凝膠電泳中分離 凝膠遷移復合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍色素的加樣溶液只能加入到陰性對照反應中,因這兩種色素會加 劇NF-kB復合物的解離。當用HeLa細胞核抽提物作為結合蛋白來源時,可形成兩種序列特異的凝膠遷移復 合物,即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達p49,p50,p65的細胞中,可檢測到4個序列 特異的凝膠遷移復合物(p49/ p49,p50/ p50,p50/ p65,p49/ p65),如果存在高濃度的p65,可檢測到 微量的p65/p65。 

下列試劑可加強NF-kB在體外的結合:mM的GTP,ATP,精胺,亞精胺,鋇或鈣離子,ng的Co+3(NH3)6 (12)。 

提取組織或細胞核蛋白,利用不同形式的NF-Κb p65抗體捕獲細胞核蛋白并加以區分,通過酶標儀450nm 處測定核蛋白標準品與NF-Κb p65吸光度值,進行定量比較,從而明確目的蛋白的活化度。


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【平臺項目開展范圍】慢病毒,腺病毒,RNAi類,分子生物實驗,病理實驗,免疫學實驗,細胞實驗,動物實驗,蛋白組 學實驗,芯片類實驗,并為廣大客戶朋友們提供課題設計指導、基金申請指導等服務。 

【星森林生物】已開展了數千個實驗外包項目。我們專注于醫學課題研究,已從課題申請、方案設計、試劑采購、模型構造、 標本檢測、數據分析,各個環節積累了數千個成功案例經驗,為數千個來自臨床的科研工作者解決了大量的科研問題。更多相關實驗服務信息請咨詢星森林生物。

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