同位素標記定量:
iTRAQ(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)&TMT(Tandem Mass Tags)分別由AB Sciex公司和 Thermo公司研發的多肽體外標記定量技術,利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或者賴氨酸側鏈基團,不同分子量的試 劑對不同來源的樣品進行標記從而實現不同樣品間蛋白質組的比較。
iTRAQ實驗步驟:
1.樣品準備:將待測樣品進行定量計算出樣品蛋白濃度;
2.蛋白還原烷基化及酶解:每組樣品各取100μg按照iTRAQ試劑盒要求進行處理,使用測序級胰蛋白酶溶液酶解后,超濾管 離心收集酶解肽段;
3.iTRAQ標記:將iTRAQ試劑平衡到室溫,用150μL異.丙.醇溶解,取酶解肽段加入iTRAQ試劑后室溫反應2 h,加入水終止 反應,等量混合不同組樣品,真空冷凍干燥樣品;
4.LC-MS-MS分析:使用Thermo的Q-Exactive Orbitrap進行串聯質譜鑒定。
5. 數據處理及生信分析
結果展示:
實驗周期及交付標準
1.實驗周期:4-6周
2.交付標準:蛋白定量結果、鑒定結果、質譜原始數據、生信分析結果(GO分析、KEGG分析等等)
需確認的信息
1.樣本的種屬
2.樣本的類型(組織or細胞or血液)
3.樣本的數量及分組
4. 分析要求
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