抗酒石酸酸性磷酸酶染色,又稱Trap染色,是用于檢測骨、骨細胞中破骨細胞的染色,使破骨細胞呈紅色,細胞核淺藍色, 用以顯示破骨細胞的分布及數量變化。
Trap染色是用于檢測骨組織、骨細胞中特征物質的染色,使破骨細胞呈紅色,背景呈綠色或藍色??咕剖崴嵝粤姿崦?(Trap)為破骨細胞的標志酶,特異地分布于破骨細胞中,為破骨細胞所特有,通常作為鑒別破骨細胞的重要標志物。在含 酒石酸的酸性條件下,trap能將萘酚AS-BI磷酸鹽水解,產生的萘酚AS-BI立即與fast red或六偶氮副品紅結合,在酶活性部 位形成不溶性的紅色染料,通過觀察紅色染料的形成可間接了解酸性磷酸酶的活性,進一步鑒別及分析破骨細胞的狀態。
骨組織切片及trap染色實驗步驟
1、骨組織脫鈣:新鮮骨組織固定于4%多聚jia醛24h以上。將組織從固定液取出置于EDTA脫鈣液內脫鈣(不能用含酸的脫 鈣液脫鈣),每3天換一次脫鈣液,至骨組織針扎可以順利通過為止。
2、取材:在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整,將修切好的組織和對應的標簽放于脫水盒內。
3、脫水:將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水 乙醇I 30min-無水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蠟I 1h-蠟II 1h-蠟III 1h。 4、 包埋:將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框,待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出按照包埋 面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽。于-20°凍臺冷卻,蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。
4、切片:將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片,片厚4μm。 切片漂浮于攤片機40℃ 溫水上將組織展平,用載玻片將組 織撈起,并放進60℃ 烘箱內烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存備用。
5、 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。
6、 染液配制:A液:0.1mol/L醋酸緩沖液PH5.0:醋酸Na1.3608g+蒸餾水100ml溶解,用Bing醋酸調PH值到5.0。B液:六 偶氮副品紅 4%亞肖酸Na:2g亞肖酸Na+去離子水50ml 副品紅溶液:副品紅2.5g+去離子水50ml+濃鹽酸7.5ml,加熱至90°溶解后過濾,4°棕色瓶保存。臨用前4%亞肖酸Na與副品 紅溶液等比例混合。 C液:萘酚AS-BI磷酸酯20mg+N,N-2甲基甲酰胺1ml溶解。 孵育液配制:A液18ml+B液1ml+C液1ml混勻,用1M NaOH或1M鹽酸調pH至5.0,再加酒石酸鉀Na0.282g,充分溶解過濾 后備用即為TRAP孵育液。
7、 染色:切片置于TRAP孵育液內37°孵育50min,鏡下觀察破骨細胞呈酒紅色為止。蒸餾水漂洗。
8.蘇木素染細胞:切片入Harris蘇木染3-8min,自然水洗,1%的鹽酸酒精分化數秒,自然水沖洗,0.6%氨.水返藍,流水沖洗。
9.脫水封片:將切片依次放入95%酒精l 5min-95%無水乙醇II5min-二甲苯I5min-二甲苯II5min中脫水透明,將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片。
10.顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。染色結果:破骨細胞胞漿呈酒紅色,核藍色。
注意事項
1、試劑配制的過程中,各個試劑的PH值一定要準確,PH不準會導致酶不能被有效激活,導致染色結果不佳。
2、亞硝酸Na溶液不穩定,容易被氧化,在使用時避免帶入雜質,并且為了確保染色結果,最好一到兩個星期更換一次。
3、染trap的骨組織最好用EDTA脫鈣,用酸脫鈣的組織切片trap為陰性。
結果展示
結果判讀:
破骨細胞呈酒紅色或淺紅色,細胞核呈淺藍色
送樣運輸要求:
1.樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上,常溫運輸送樣。切勿固定時間過長,切勿冷凍結冰。
2.石蠟切片常溫運輸。
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